一、總則
適用范圍：本方法適用于醫(yī)療、衛(wèi)生、食品等行業(yè)的殺菌和抑菌試驗(yàn)。
引用標(biāo)準(zhǔn)：消毒技術(shù)規(guī)范2002
二、術(shù)語(yǔ)
消毒 disinfection
殺滅或清除傳播媒介上病原微生物,使其達(dá)到無(wú)害化的處理。
滅菌 sterilization
殺滅或清除傳播媒介上一切微生物的處理。
消毒劑 disinfectant
用于殺滅傳播媒介上的微生物使其達(dá)消毒或滅菌要求的制劑。
滅菌劑 sterilant
可殺滅一切微生物(包括細(xì)菌芽孢)使其達(dá)到滅菌要求的制劑。
殺滅時(shí)間 killing time, KT
用于生物指示物抗力鑒定時(shí), 指受試指示物樣本，經(jīng)殺菌因子作用不同時(shí)間后, 培養(yǎng)后的全部樣本均無(wú)菌生長(zhǎng)的最短作用時(shí)間 (min)
殺滅率 killing rate, KR
在微生物殺滅試驗(yàn)中，用百分率表示微生物數(shù)量減少的值，以其表達(dá)殺滅效果。
滅對(duì)數(shù)值 killing log value
微生物數(shù)量以對(duì)數(shù)表示時(shí)，消毒后與消毒前比較, 以其減少的對(duì)數(shù)值來(lái)表達(dá)殺滅效果。
三、菌懸液與菌片的制備
(一) 試驗(yàn)前應(yīng)選擇合適的細(xì)菌，在下述規(guī)定中表中‘+’為必做試驗(yàn)的微生物 ，根據(jù)消毒劑特定用途或試驗(yàn)特殊需要，還可增選其他菌株。
(二) 試驗(yàn)器械
A. 無(wú)菌蒸餾水
B. 細(xì)菌培養(yǎng)基：胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA），胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）和營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基等
C. 刻度吸管（1.0ml、5.0ml、10.0ml），毛細(xì)吸管。
D. 數(shù)字可調(diào)移液器（10μl~200μl）及配套用一次性塑料吸頭。
E. 濁度計(jì)
F. 游標(biāo)卡尺
(三) 細(xì)菌繁殖體懸液的制備
1 取凍干菌種管，在無(wú)菌操作下打開(kāi)，以毛細(xì)吸管加入適量營(yíng)養(yǎng)肉湯，輕柔吹吸數(shù)次，使菌種融化分散。取含 5.0 ml～10.0ml 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基試管，滴入少許菌種懸液，置 37 ℃ 培養(yǎng)18h～24h。 用接種環(huán)取第 1 代培養(yǎng)的菌懸液，劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，于 37℃ 培養(yǎng) 18h～24h。挑取上述第 2 代培養(yǎng)物中典型菌落，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，于 37℃ 培養(yǎng) 18h～24h，即為第3 代培養(yǎng)物。
2 取菌種第 3代～14 代的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物（18h～24h），用 5.0ml 吸管吸取 3.0 ml～5.0ml 稀釋液加入斜面試管內(nèi)，反復(fù)吹吸，洗下菌苔。隨后，用5.0ml 吸管將洗液移至另一無(wú)菌試管中，用電動(dòng)混合器混合（振蕩）20s，或在手掌上振敲 80 次，以使細(xì)菌懸浮均勻。
3 初步制成的菌懸液，先用細(xì)菌濃度比濁測(cè)定法粗測(cè)其含菌濃度，然后以稀釋液稀釋至所需使用的濃度。
4 細(xì)菌繁殖體懸液應(yīng)保存在 4℃ 冰箱內(nèi)備用。應(yīng)當(dāng)天使用不得過(guò)夜。
5 懷疑有污染時(shí)，應(yīng)以菌落形態(tài)、革蘭染色與生化試驗(yàn)等法進(jìn)行鑒定。
四、菌片的制備程序
1 滴染法染菌時(shí)，先用濁度計(jì)測(cè)定的菌懸液濃度，調(diào)至含菌量為1～5×108cfu/ml將經(jīng)滅菌的載體片平鋪于無(wú)菌平皿內(nèi)，菌液滴加量每片為10μl。用10μl移液器 接滅菌塑料吸頭，滴染菌液，并用接種環(huán)涂勻整個(gè)載體表面。滴染菌液后，染菌載體可置37℃溫箱內(nèi)烤干（約20min～30min），或置室溫下自然陰干后再使用。
2 每個(gè)菌片的染菌量，即回收菌數(shù)，按活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)所得結(jié)果，應(yīng)為 5×105 cfu/片～5×106 cfu/片。
3 配制菌懸液和制備菌片時(shí)，保持環(huán)境的潔凈和安靜，嚴(yán)格按無(wú)菌要求操作，以防污染雜菌，影響隨后殺菌試驗(yàn)的結(jié)果。
五、活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)技術(shù)
1 取含 5.0ml 稀釋液無(wú)菌試管，對(duì)菌片或小型固體樣本直接投入即可，對(duì)棉拭則將其采樣端剪入管內(nèi)，每管一份樣本。而后，用手掌上用力振敲 80 次，形成菌懸液。
2 將試管按需要數(shù)量分組排列于試管架上， 每管加入 4.5ml 稀釋液。各組由左向右，逐管標(biāo)上 10-1、10-2、10-3......等。
3 將菌懸液樣本在手掌上用力振敲 80次，吸取 0.5ml加至 10-1 管內(nèi)。
4 將 10-1 管依前法在手掌上用力振敲 80次，混勻，再吸取出 0.5ml 加入10-2 管內(nèi)。如此類(lèi)推，直至最后一管。
5 選擇適宜稀釋度試管（以預(yù)計(jì)生長(zhǎng)菌落數(shù)每平板為 30cfu～300cfu 者為宜），吸取混合均勻的懸液 1.0ml 加于無(wú)菌平皿內(nèi)。每一稀釋度接種 3個(gè)平皿。需接種2個(gè)～3個(gè)不同稀釋度。
6 將冷至 40℃～45℃ 的熔化營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，傾注于已加入樣液的平皿中，每平皿 15ml～20ml。置 37℃ 溫箱內(nèi)培養(yǎng)
7）每日觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。培養(yǎng)至規(guī)定時(shí)間（細(xì)菌繁殖體為 48h，白色念珠菌與細(xì)菌芽孢為 72h），計(jì)數(shù)最終結(jié)果的菌落數(shù)。
六、殺菌試驗(yàn)
1 首先按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)要求配制消毒液。一律使用無(wú)菌硬水配制，配制的濃度為待測(cè)濃度的1.25倍，置20℃±1℃ 水浴備用。取已配制濃度為1×108cfu/ml～5×108cfu/ml,(實(shí)際作用時(shí)菌濃度為107cfu/ml）。在無(wú)菌大試管，先加入0.5ml有機(jī)干擾物質(zhì)，再加入0.5ml試驗(yàn)用菌懸液，混勻，置 20℃±1℃ 水浴中5min后，用無(wú)菌吸管吸取上述濃度消毒液 4.0 ml 注入其中，迅速混勻并立即記時(shí)。
2 待菌藥相互作用至各預(yù)定時(shí)間，分別吸取 0.5ml 菌藥混合液加于 4.5ml 經(jīng)滅菌的中和劑中，混勻。
3 各管菌藥混合液經(jīng)加中和劑作用 10min 后，分別吸取 1.0ml樣液，按活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)方法測(cè)定存活菌數(shù)，每管樣液接種 2 個(gè)平皿。如平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)較多時(shí)，可進(jìn)行系列10倍稀釋后，再進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。
4 同時(shí)用稀釋液代替消毒液，進(jìn)行平行試驗(yàn)，作為陽(yáng)性對(duì)照。
5 所有試驗(yàn)樣本均在 37℃ 溫箱中培養(yǎng)，對(duì)細(xì)菌繁殖體培養(yǎng)48h 觀察最終結(jié)果；對(duì)細(xì)菌芽孢需培養(yǎng) 72h 觀察最終結(jié)果。
6 試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算各組的活菌濃度 （cfu/ml），并換算為對(duì)數(shù)值（N），并按下式計(jì)算殺滅對(duì)數(shù)值：
殺滅對(duì)數(shù)值 (KL)＝對(duì)照組平均活菌濃度的對(duì)數(shù)值（No）-試驗(yàn)組活菌濃度對(duì)數(shù)值（Nx）
1) 在懸液定量殺滅試驗(yàn)中,各次試驗(yàn)陰性對(duì)照無(wú)菌生長(zhǎng)，陽(yáng)性對(duì)照回收菌數(shù)在1×107cfu/ml～5×107cfu/ml范圍內(nèi)，各次試驗(yàn)的殺滅對(duì)數(shù)值均≥5，為消毒合格。
2) 在載體定量殺滅試驗(yàn)中，各次試驗(yàn)陰性對(duì)照無(wú)菌生長(zhǎng)，陽(yáng)性對(duì)照回收菌數(shù)在5×105cfu/片～5×106 cfu/片范圍內(nèi)，各次試驗(yàn)的殺滅對(duì)數(shù)值均≥3，為消毒合格。
3) 空氣消毒實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)和模擬現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)，各次試驗(yàn)陰性對(duì)照無(wú)菌生長(zhǎng)，陽(yáng)性對(duì)照菌數(shù)均在5×104 cfu/m3～5×105cfu/m3范圍內(nèi)，各次試驗(yàn)的殺滅率≥99.90%，現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)各次自然菌消亡率≥90.00%,為消毒合格。
七、抑菌試驗(yàn)
1) 抑菌片的制備：取無(wú)菌并干燥的濾紙片。每片滴加抑菌劑溶液 20μl，后將濾紙片平放于清潔的無(wú)菌平皿內(nèi)，開(kāi)蓋置溫箱(37℃) 中烤干，或置室溫下自然干燥后備用。 溶出性抗（抑）菌產(chǎn)品，可直接制成直徑為 5mm，厚不超過(guò) 4mm圓片(塊)，每 4 片(塊) 一組。
2) 陰性樣片的制備：取無(wú)菌干燥濾紙片，每片滴加無(wú)菌蒸餾水 20μl，干燥后備用。溶出性抗（抑）菌產(chǎn)品的陰性對(duì)照樣本，取同種材質(zhì)不含抑菌成份的相同大小的樣品。
3) 試驗(yàn)菌的接種：用無(wú)菌棉拭子蘸取濃度為 5～5×106cfu/ml 試驗(yàn)菌懸液，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板表面均勻涂抹3次。每涂抹1次，平板應(yīng)轉(zhuǎn)動(dòng) 60°，最后將棉拭子繞平板邊緣涂抹一周。蓋好平皿，置室溫干燥 5min。
4) 抑菌劑樣片貼放：每次試驗(yàn)貼放1個(gè)染菌平板，每個(gè)平板貼放4片試驗(yàn)樣片，1 片陰性對(duì)照樣片，共 5 片。用無(wú)菌鑷子取樣片貼放于平板表面。各樣片中心之間相距 25mm以上，與平板的周緣相距 15 mm 以上。貼放好后，用無(wú)菌鑷子輕壓樣片，使其緊貼于平板表面。蓋好平皿，置37℃溫箱，培養(yǎng)16h～18h 觀察結(jié)果。用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌環(huán)的直徑 (包括貼片) 并記錄。試驗(yàn)重復(fù)3次。
5) 測(cè)量抑菌環(huán)時(shí)，應(yīng)選均勻而完全無(wú)菌生長(zhǎng)的抑菌環(huán)進(jìn)行。 測(cè)量其直徑應(yīng)以抑菌環(huán)外沿為界。
6)評(píng)價(jià)規(guī)定
抑菌作用的判斷：
抑菌環(huán)直徑大于 7mm 者, 判為有抑菌作用。
抑菌環(huán)直徑小于或等于 7mm 者, 判為無(wú)抑菌作用。
3 次重復(fù)試驗(yàn)均有抑菌作用結(jié)果者, 判為合格。
陰性對(duì)照組應(yīng)無(wú)抑菌環(huán)產(chǎn)生。否則試驗(yàn)無(wú)效。
