摘要：隨著生命科學(xué)與生物技術(shù)的快速發(fā)展，國(guó)際上農(nóng)畜產(chǎn)品安全檢測(cè)技術(shù)正在向著檢測(cè)方法與技術(shù)的通量化、快速化、自動(dòng)化和智能化等方向發(fā)展。而免疫檢測(cè)方法由于其具有特異性和靈敏性、其試劑具有穩(wěn)定性、操作具有簡(jiǎn)便性，因此適合推廣應(yīng)用。其中蛋白芯片法與傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）方法比較，具有高通量，樣品用量少，一份樣品可同時(shí)進(jìn)行多指標(biāo)分析，大大降低了檢測(cè)的成本，提高了檢測(cè)的效率，并且檢測(cè)限與靈敏度等均與ELISA方法相當(dāng)。動(dòng)物源性食品種類和成分較為復(fù)雜，目標(biāo)化合物的檢測(cè)限較低，各目標(biāo)化合物的性質(zhì)差異大，且可能同時(shí)存在多種組分。因此，近年來蛋白芯片在食品安全檢測(cè)等領(lǐng)域的應(yīng)用也日漸增多。本文就蛋白芯片技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，以期為食品安全現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)提供參考。

　　關(guān)鍵詞：蛋白芯片；食品安全檢測(cè)；綜述
 

　　1 引言

　　20世紀(jì)80年代末以來，由于一系列食品原料的化學(xué)污染、畜牧業(yè)中抗生素的應(yīng)用、基因工程技術(shù)的應(yīng)用，使食品污染導(dǎo)致的食源性疾病呈上升趨勢(shì)，食品安全問題為全世界所關(guān)注?，F(xiàn)場(chǎng)的食品快速檢測(cè)方法要求實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備簡(jiǎn)化，使用的試劑較少，配制好的試劑保存期長(zhǎng)；樣品前處理簡(jiǎn)單，對(duì)操作人員要求低；分析方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確和快速?；瘜W(xué)比色法、酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和免疫膠體金試紙法是目前應(yīng)用比較成熟的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方法。隨著食品安全相關(guān)檢測(cè)裝備的進(jìn)步，食品安全檢測(cè)車的出現(xiàn)，一些新的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)技術(shù)得以應(yīng)用，如蛋白芯片技術(shù)的加入為現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供了更廣闊的發(fā)展空間。本文就蛋白芯片技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，以期為食品安全現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)提供參考。
 

　　2 蛋白芯片概述

　　蛋白芯片技術(shù)是近年來蛋白質(zhì)組學(xué)研究中興起的一種新方法，它是在基因芯片的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。蛋白芯片技術(shù)主要采用微陣列點(diǎn)樣等方法將大量生物大分子如抗原或抗體等樣品有序地固定在玻片、膜、硅膠片、多孔板等支持物的表面，組成密集的二維分子陣列，然后與標(biāo)記的待測(cè)生物樣品中的靶分子實(shí)現(xiàn)特異性反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果用化學(xué)發(fā)光法、熒光法、酶催化底物顯色法、同位素法等方法顯示，最后通過特定的儀器對(duì)信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)行快速、并行、高效地檢測(cè)分析，并進(jìn)行數(shù)字化處理提供定性和定量分析結(jié)果，判斷樣品中靶分子的含量，從而達(dá)到分析檢測(cè)的目的。
 

　　蛋白芯片技術(shù)不僅適用于大分子化合物（如蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)菌）的檢測(cè)，也適用于小分子化合物（如抗生素、激素等）的測(cè)定。蛋白芯片法與傳統(tǒng)ELISA方法比較，具有高通量，樣品用量少，一份樣品可同時(shí)進(jìn)行多指標(biāo)分析等優(yōu)勢(shì)，大大降低了檢測(cè)的成本，提高了檢測(cè)的效率，并且檢測(cè)限與靈敏度等均與ELISA方法相當(dāng)。動(dòng)物源性食品種類和成分較為復(fù)雜，目標(biāo)化合物的檢測(cè)限較低，各目標(biāo)化合物的性質(zhì)差異大，且可能同時(shí)存在多種組分。因此，近年來蛋白芯片在食品安全檢測(cè)等領(lǐng)域的應(yīng)用也日漸增多。
 

　　3 蛋白芯片在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用
 

　　蛋白芯片分析方法在食品中的農(nóng)獸藥殘留、生物毒素殘留、食源性致病微生物及轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)等方面具有巨大的應(yīng)用潛力，具有使用樣品體積少，不需要復(fù)雜的樣品預(yù)處理，并且高通量和快速等特點(diǎn)。
 

　　3.1 在農(nóng)獸藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用

　　在食品安全檢測(cè)中，農(nóng)獸藥殘留檢測(cè)是非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。在實(shí)際生產(chǎn)過程中，快速篩選方法比實(shí)驗(yàn)室中確證的定量分析更具有實(shí)際意義，而蛋白芯片具有高通量、快速的檢測(cè)特點(diǎn)正適用于大規(guī)模生產(chǎn)中的快速篩選。Knecht等在硅烷化修飾的片基上制備10種抗生素抗原點(diǎn)陣，包括β-內(nèi)酰胺類、磺胺類及氨基糖苷類等，通過化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)牛奶中抗生素殘留含量。整個(gè)檢測(cè)過程只需5min，且實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化。Kloth等建立的蛋白芯片間接競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光免疫法，能在幾分鐘內(nèi)同時(shí)定量檢測(cè)牛奶中磺胺類、β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類和氟喹諾酮類等13種抗生素含量。該方法靈敏度較高，但化學(xué)發(fā)光的檢測(cè)設(shè)備較昂貴，很難在基層推廣應(yīng)用。劉楠等建立了一種高通量懸浮蛋白芯片檢測(cè)方法，將方法首先應(yīng)用于氯霉素和克倫特羅兩種獸藥殘留的同時(shí)高通量檢測(cè)，此后應(yīng)用于氯霉素、克倫特羅、雌二醇、泰樂菌素4種獸藥和阿特拉津、吡蟲啉、甲萘威3種農(nóng)藥的同時(shí)檢測(cè)，整個(gè)檢測(cè)過程只需1～2h，可滿足多種農(nóng)獸藥殘留檢測(cè)的靈敏、特異、快速和高效的需求。左鵬等報(bào)道了一種基于載玻片的熒光免疫微陣列蛋白芯片法，用于同時(shí)檢測(cè)食品中氯霉素和磺胺二甲嘧啶2種抗生素殘留，以及牛奶中磺胺二甲嘧啶、鏈霉素和泰樂菌素3種抗生素的含量，該方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、可滿足大量樣本快速初篩，檢測(cè)限均低于國(guó)家規(guī)定的最大允許殘留量。Liu等用熒光免疫微陣列蛋白質(zhì)芯片法同時(shí)測(cè)定鰻魚中孔雀石綠、己烯雌酚、甲羥孕酮和3-氨基-2-惡唑烷酮的含量。并將該蛋白質(zhì)微陣列方法與用于這四種分析物的市售試劑盒進(jìn)行比較，兩種方法的結(jié)果一致。Raz等描述了基于表面等離子體共振的免疫傳感器建立了牛奶中氨基糖苷類（新霉素、慶大霉素、卡那霉素和鏈霉素），磺胺類（磺胺二甲嘧啶），氯霉素類（氯霉素）和氟喹諾酮類（恩諾沙星）殘留物的無標(biāo)記多重檢測(cè)系統(tǒng)。多重殘留的檢測(cè)可用于測(cè)量μg/L水平的所有目標(biāo)化合物，其對(duì)于歐盟確定的最大允許殘留水平的牛奶控制足夠敏感。本實(shí)驗(yàn)室基于可視化微孔板芯片開發(fā)了多種檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了同時(shí)檢測(cè)牛奶中慶大霉素，牛奶中磺胺類和喹諾酮類，牛奶中諾氟沙星和惡喹酸，牛奶中黃曲霉毒素，頭孢氨芐，三聚氰胺，以及蜂蜜中四環(huán)素，蜂蜜中4種硝基呋喃代謝物的同時(shí)檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度高，可滿足高通量快速檢測(cè)需求。此外，基于智能手機(jī)可視化微孔板芯片同時(shí)檢測(cè)牛奶中喹諾酮類和四環(huán)素類抗生素殘留檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)單孔定量檢測(cè)。目前蛋白芯片法檢測(cè)各種殘留物為食品生產(chǎn)企業(yè)對(duì)產(chǎn)品出廠的把關(guān)，以及相關(guān)部門對(duì)食品質(zhì)量安全的快速抽查提供了技術(shù)支持。
 

　　3.2 在生物毒素殘留檢測(cè)中的應(yīng)用

　　在過去的幾十年里，農(nóng)業(yè)食品系統(tǒng)中的霉菌毒素污染一直是全球的一個(gè)嚴(yán)重問題。真菌毒素是真菌在農(nóng)產(chǎn)品和飼料中生長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生的有毒次生代謝產(chǎn)物。近年來開發(fā)了多種霉菌毒素的檢測(cè)技術(shù)，基于免疫的蛋白芯片檢測(cè)方法由于其靈敏度高和檢測(cè)時(shí)間短而得到了廣泛應(yīng)用。Wang等開發(fā)了一種免疫芯片，可在4h內(nèi)同時(shí)定量檢測(cè)水中黃曲霉毒素B1，黃曲霉毒素M1，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，豬曲霉毒素A，T-2毒素和玉米赤霉烯酮6種霉菌毒素的濃度，具有使用樣品量少和肉眼可視半定量的優(yōu)點(diǎn)。Hu等研究了一種基于無污染聚合物刷的熒光競(jìng)爭(zhēng)免疫測(cè)定微陣列用于黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1），赭曲霉毒素A（ochratoxinA，OTA）和玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）多種真菌毒素的靈敏檢測(cè)，檢測(cè)限分別為4，4和3pg/mL，并且與常規(guī)ELISA方法相當(dāng)或甚至更好。Li等基于表面增強(qiáng)拉曼散射（surface enhanced Ramanscattering，SERS）的免疫傳感器被開發(fā)用于檢測(cè)食品中的3種真菌毒素（AFB1、ZEA、OTA）。測(cè)定的檢測(cè)限AFB1為0.061～0.066μg/kg，ZEA為0.53-0.57μg/kg，OTA為0.26-0.29μg/kg。Wang等使用3D等離子體納米柱陣列的表面增強(qiáng)拉曼散射對(duì)多種霉菌毒素（OTA、伏馬菌素B（Fumonisin B，F(xiàn)UMB）和AFB1）進(jìn)行免疫分析。對(duì)于OTA、FUMB和AFB1，檢出限（limit of detection，LOD）被確定為5.09、5.11、6.07pg/mL。Pagkali等（321介紹了一種無標(biāo)記的光學(xué)生物傳感器，用于快速同時(shí)測(cè)定啤酒樣品中的黃曲霉毒素B1（AFB1），伏馬菌素B1（fumonisinsB1，F(xiàn)B1）和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）3種霉菌毒素。AFB1、FB1、DON的檢測(cè)限分別為0.8、5.6、24ng/mL，而檢測(cè)時(shí)間僅為12min。表面等離子體共振成像（surface plasmon resonanceimaging，SPRi）是無標(biāo)記，實(shí)時(shí)和高通量免疫測(cè)定的強(qiáng)大工具，但其靈敏度需要必要的改進(jìn)。Wei等到報(bào)道了單層石墨烯涂層金芯片可以有效地增強(qiáng)表面等離子體共振（surface plasma resonance，SPR）的靈敏度。以抗玉米赤霉烯酮（ZEN）為研究對(duì)象，結(jié)果表明檢測(cè)信號(hào)可以增強(qiáng)40%。Schulz等基于電化學(xué)生物芯片用于快速和便攜式自動(dòng)化現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)蛤蚌毒素，T-2毒素以及黃曲霉毒素M1及其相應(yīng)的同源物等低分子量毒素，能夠在17min內(nèi)檢測(cè)到ng/mL水平。Beloglazova等使用基于量子點(diǎn)（quantum dot，QDs）的免疫化學(xué)技術(shù)開發(fā)了多重?zé)晒饷庖呶綔y(cè)定（fluorescence immunosorbent assay，F(xiàn)LISA）方法。使用基于直接競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定法同時(shí)檢測(cè)ZEA和AFB1，檢出限為1.8和1μg/kg。
 

　　3.3 在食源性致病微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

　　食源性致病微生物是食源性流行病的原因，因此需要迅速檢測(cè)食品中的病原體。在瓊脂平板上接種進(jìn)行預(yù)富集培養(yǎng)是標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，qPCR的分子檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)了24h內(nèi)檢測(cè)病原體。此外，生物傳感器可以在富集培養(yǎng)早期實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。Magliulo等已經(jīng)開發(fā)了一種簡(jiǎn)單快速的多重夾心化學(xué)發(fā)光酶免疫測(cè)定法，用于同時(shí)檢測(cè)大腸桿菌0157：H7（Escherichia coli O157：H7）、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。為了實(shí)現(xiàn)4種病原體的多重檢測(cè)，設(shè)計(jì)了一種新的聚苯乙烯96孔微量滴定板形式，其中每個(gè)主要孔在底部包含4個(gè)子孔。對(duì)每種細(xì)菌特異的單克隆抗體分別固定在每個(gè)子孔中。當(dāng)將樣品加入主孔中時(shí)，能夠特異性結(jié)合相應(yīng)單克隆抗體的細(xì)菌被捕獲在4個(gè)子孔中的一個(gè)。隨后，加入針對(duì)4種細(xì)菌的過氧化物酶標(biāo)記的多克隆抗體混合物，并使用基于魯米諾的化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)。該測(cè)定簡(jiǎn)單快速，所有細(xì)菌種類的定量限為104～105CFU/mL。通過將結(jié)果與常規(guī)培養(yǎng)方法進(jìn)行比較來評(píng)估該方法的準(zhǔn)確性，結(jié)果令人滿意，回收率為90%～120%。該方法可用作篩選試驗(yàn)，以評(píng)估這些病原菌在不同食品中的含量。熊亮斌等在硝酸纖維素膜上制備的可視化蛋白芯片，可檢測(cè)西瓜中果斑病菌，具有較好的特異性和重復(fù)性。與酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）相比，可視化蛋白芯片的檢測(cè)靈敏度和陽性檢出率均相當(dāng)，但檢測(cè)時(shí)間更短，僅為ELISA法的八分之一，所需檢測(cè)樣本量更少，結(jié)果肉眼可視等優(yōu)點(diǎn)。胡娟等也在硝酸纖維素膜上制備的可視化蛋白芯片，用于黃瓜綠斑駁花葉病毒的檢測(cè)，以50批葫蘆科種子為樣品，對(duì)可視化蛋白芯片檢測(cè)與ELISA檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了比較，其檢測(cè)結(jié)果吻合率達(dá)98.0%，經(jīng)PCR檢驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果一致性良好。說明該方法能對(duì)植物病毒做出快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)。Palmiro等剛開發(fā)并測(cè)試了一種蛋白質(zhì)芯片，用于篩選和鑒定5種常見病原體，包括沙門氏菌，大腸桿菌（E. coli），金黃色葡萄球菌，彎曲桿菌和李斯特菌，該蛋白質(zhì)芯片在病原體鑒定中具有高度特異性，可以快速，可靠地篩選出污染食品中這5種常見病原體。
 

　　3.4 在轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)中的應(yīng)用

　　隨著全球轉(zhuǎn)基因技術(shù)的迅猛發(fā)展，研究人員利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出了抗除草劑、抗重金屬、抗病蟲害、抗干旱、耐鹽堿和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的品種，這對(duì)于提高產(chǎn)量、減少損失以及增加農(nóng)產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值具有重要作用。然而轉(zhuǎn)基因作物在帶來巨大社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)也存在許多問題，主要集中在轉(zhuǎn)基因食品的安全性及對(duì)生態(tài)環(huán)境的安全性方面。因此世界各國(guó)都在加強(qiáng)對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的管理。蛋白芯片法可以檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因食品中外源基因表達(dá)出來的蛋白質(zhì)，汪琳等研制了一種蛋白芯片可同時(shí)檢測(cè)3種轉(zhuǎn)基因成分表達(dá)的BTCry1Ac蛋白、植酸酶蛋白、BTCrylAh蛋白。將3種蛋白質(zhì)所對(duì)應(yīng)的單克隆抗體點(diǎn)于環(huán)氧基修飾的片基上，其檢測(cè)靈敏度分別為：BTCry1Ac蛋白35ng/mL、植酸酶蛋白20ng/mL、BTCry1Ah蛋白30ng/mL，具有較高的靈敏度、特異性和可靠性。
 

　　3.5 在動(dòng)物疫病檢測(cè)中的應(yīng)用

　　病毒感染是全世界畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病率的主要原因。血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)包括血細(xì)胞凝集抑制（hemagglutination inhibition，HI）、瓊脂凝膠沉淀素（AGAR gel precipitin，AGP）測(cè)試、免疫熒光測(cè)定（immunofluorescence assay，IFA）和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）等。雖然這些方法的價(jià)值和重要性是顯而易見的，但它們不能同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。蛋白芯片法可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)血清樣品中的抗體。石霖等利用可視化蛋白芯片法對(duì)禽流感、新城疫2種禽病血清抗體和禽流感、新城疫、雞傳染性支氣管炎和傳染性法氏囊病4種禽病血清抗體同時(shí)檢測(cè)。該芯片具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏、特異性的特點(diǎn)，無需特殊儀器，成本低。血清樣品檢測(cè)可信度高，且靈敏度高于瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，可推廣到基層使用。Wang等開發(fā)了一種可視化蛋白芯片可以同時(shí)檢測(cè)禽流感病毒，新城疫病毒，傳染性支氣管炎病毒和傳染性法氏囊病病毒誘導(dǎo)的抗體。與傳統(tǒng)方法相比，該蛋白芯片顯示出良好的靈敏度，是瓊脂凝膠沉淀法的400倍以上，且相互之間無交叉反應(yīng)。Sheng等制備的瓊脂糖凝膠蛋白芯片，實(shí)現(xiàn)了對(duì)魚淋巴囊腫病毒的檢測(cè)。通過優(yōu)化瓊脂糖凝膠基片表面的化學(xué)結(jié)構(gòu)和檢測(cè)抗體的標(biāo)記物等，實(shí)現(xiàn)魚淋巴囊腫病毒的最低檢測(cè)限為0.0686μg/mL，與酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）的一致率為100%，免疫熒光測(cè)定技術(shù)的一致率為98%。趙玉輝等建立一種檢測(cè)A型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）抗體的蛋白芯片，利用蛋白芯片分別對(duì)15個(gè)亞型流感病毒免疫血清、SPF雞血清、抗新城疫病毒血清、抗法氏囊病毒血清和現(xiàn)地血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，通過與血凝抑制試驗(yàn)比較，表明建立的蛋白芯片方法具有良好的靈敏性和特異性，為AIV抗體檢測(cè)及制備檢測(cè)AIV不同亞型或多種病原抗體的蛋白芯片提供方法。顧大勇等將禽流感病毒H1、H3、H5、H7、H9、N1、N2、NP、NS1等9種亞型抗原以最佳濃度，點(diǎn)樣于玻璃載體表面，構(gòu)建相應(yīng)抗體的檢測(cè)芯片，分別用于禽類不同類型禽流感病毒血清及隨機(jī)選擇的人血清檢測(cè)，并對(duì)特異性、敏感性及重復(fù)性進(jìn)行測(cè)試，與血凝抑制法進(jìn)行雙向驗(yàn)證比較，結(jié)果一致。劉志玲等建立了牛地方流行性白血病的液相蛋白芯片檢測(cè)方法，檢測(cè)結(jié)果與ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果的符合率為94.6%，為牛地方流行性白血病的進(jìn)出境檢疫、疫病監(jiān)測(cè)和流行學(xué)調(diào)查研究提供了一種特異、敏感的新型快速檢測(cè)技術(shù)。曾夢(mèng)等建立了豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的熒光微球免疫學(xué)檢測(cè)方法，紀(jì)方曉等建立了豬戊型肝炎病毒液相蛋白芯片檢測(cè)方法，方法與商品化ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果一致，為建立豬病多重檢測(cè)方法提供了基礎(chǔ)。
 

　　4 總結(jié)與展望

　　已報(bào)道的蛋白芯片方法相比于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法如色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù)雖有多靶標(biāo)、快速、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，但是存在諸如檢測(cè)儀器復(fù)雜、價(jià)格昂貴、操作繁瑣、通量低等問題，不適合在基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)和小的食品生產(chǎn)企業(yè)推廣應(yīng)用。本課題組建立的基于可視化蛋白芯片的檢測(cè)方法，可同時(shí)檢測(cè)多種藥物及有害物殘留引和同時(shí)檢測(cè)多種營(yíng)養(yǎng)蛋白質(zhì)的含量。與傳統(tǒng)生物芯片相比，具有可視化，可直接用肉眼觀察芯片結(jié)果，無需使用昂貴的熒光或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)設(shè)備?？梢暬镄酒瑪[脫了昂貴的生物芯片分析儀器，大大降低了檢測(cè)成本，提高了可操作性、應(yīng)用性和推廣性。